Медицина и здравоохранение сегодня

Проведение исследования

Учебные материалы / Клиническое значение выявления CagA-белка H. pylori при гастродуоденальной патологии / Материалы и методы исследования / Проведение исследования

Страница 1

Взятие, доставка и хранение материала:

Исследуемый биопсийный материал опускается в стерильную сухую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.

Пробу доставить в лабораторию в течение 2-х часов (в термосе со льдом) для выделения ДНК или заморозить и хранить при температуре - 20°C не более 2 недель.

Выделение ДНК из биопроб:

. В 1.5 мл пробирку с биоптатом добавить 100 мкл лизирующего раствора и инкубировать, периодически встряхивая, при 55оС до полного растворения ткани (это процесс занимает от 2 до 4 часов , при необходимости инкубацию можно проводить в течение ночи при 37оС).

. Осадить сконденсированные на внутренней поверхности пробирки капли жидкости центрифугированием в течение 5 сек при 8-12 тыс. об/мин. К полученному лизату добавить 20 мкл суспензии сорбента (перед добавлением суспензию тщательно перемешать) и 500 мкл раствора I . (Раствор I перед использованием прогреть на водяной бане 10 мин. при температуре 50-60оС и тщательно перемешать). Полученный раствор перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин., периодически встряхивая на вортексе.

. Осадить сорбент центрифугированием на микроцентрифуге в течение 15 сек при 8-12 тыс. об/мин. Удалить супернатант.

На всех стадиях обработки клинического материала удаление супернатанта производят одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи вакуумного насоса в колбу-ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3% хлорамин или 5% перекись водорода и т.п.)

. К осадку добавить 200 мкл раствора II, перемешать смесь, осадить сорбент центрифугированием в течение 15 сек на микроцентрифуге при 8-12 тыс. об/мин., удалить супернатант.

. Промыть сорбент 2 раза 1 мл раствора III , как описано в п.2.4

. Пробирки поместить в твердотельный термостат и подсушить сорбент 5-10 мин при температуре 55-60оС, оставляя пробирки открытыми.

. В пробирки с сорбентом добавить 50 мкл ТЕ буфера, закрыть их, тщательно перемешать на вортексе и инкубировать в течение 5 минут при 55-60оС.

. Пробирки центрифугировать 15 сек при 8-12 тыс.об/мин

Водную фазу (супернатант) использовать в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.

Водную фазу снятую с сорбента можно хранить при температуре -20оС в течение 6 месяцев.

Проведение ПЦР (амплификация):

. Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0,2 мл), включая пробирки для положительных и отрицательного контрольных образцов

. За 20-30 минут до приготовления амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для амплификации из морозильника, разморозить содержимое (желательно поместить пробирку с Taq-полимеразой в ледяную баню). Размороженные пробирки тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого.

. Из компонентов набора приготовить смесь реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

ХЕЛИКОПОЛ:

Разбавитель17,5 мкл,

Реакционная смесь32,5 мкл,полимераза0,2мкл

Рекомендуется готовить смесь реагентов не менее чем на 5 реакций для достоверной дозировки объема фермента

Для каждой смеси праймеров готовится отдельная амплификационная смесь. Все компоненты добавлять отдельными наконечниками.

. После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.

. Добавить по 20 мкл амплификационной смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации (для ХЕДИКОПОЛ СА, VA, BA и IA-по 25 мкл).

. Добавить во все пробирки по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла.

. Внести 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы (см п. выделение ДНК) в соответствующую пробирку с амплификационной смесью для проведения амплификации под слой масла.