Медицина и здравоохранение сегодня

История изобретения и принцип ПЦР

Учебные материалы / Использование молекулярно-генетических методов в методико-биологических исследованиях / История изобретения и принцип ПЦР

Страница 2

Чувствительность

Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять единичные копии в исследуемом образце.

Актуальность ответа (быстрота получения результата)

Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

Возможность доклинической и ретроспективной диагностики

ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. серонегативной фазе или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.

Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

Возможность экспертизы

Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами (Петрова, 2000).

Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен

некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа. Это, прежде всего, ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб. Поскольку, эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, так как именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Случаи тотальной контаминации выявляются без труда по появлению линии "положительной" ДНК во всех пробах, включая отрицательный контроль. Реагенты, загрязненные "положительной" ДНК, подлежат ликвидации. Повторная реакция ставится с новыми реагентами.

Вторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Приведем примеры таких ошибок.

Первая, когда не учитывает специфичность используемых тест-систем. Больной А. с предполагаемым диагнозом "респираторный хламидиоз" направлен на исследование хламидий в соскобе с задней стенки глотки. При постановке ПЦР использовалась видоспецифическая тест-система, выявляющая фрагмент генома С.trachomatis. Результат исследования отрицательный. Врач снимает предполагаемый диагноз. Однако у больного может иметь место инфекция, вызванная С. pneumonia, C. pecorum, C. psitaci, которые не улавливаются данной тест-системой. Поэтому при назначении ПЦР-исследования больному врач должен четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.

Врач не учитывает особенности персистенции и элиминации возбудителя. Больная Б. с хроническим хламидийным цервицитом направлена на контрольное исследование через 1 неделю после окончания курса антибиотикотерапии. Результат анализа положительный. Делается вывод о неэффективности проведенной терапии. Такое заключение может быть ошибочно в силу того, что погибшие и персистирующие хламидии дают положительный результат ПЦР-анализа. Окончательный вывод об излеченности можно сделать не ранее, чем через 5-6 недель после курса антибиотикотерапии. Это срок необходим для смены эпителиального слоя, в клетках которого паразитируют хламидии.

Вторая - клиническая, заключающаяся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачастую является необоснованным аргументом практических врачей для сомнения в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Поясним на примере. Показано, что только у 40% - 60% лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования, совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий - "инфицированность" и "инфекционная болезнь".

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов.